国药中生生物技术研究院（NATIONAL VACCINE & SERUM INSTITUTE，新型疫苗国家工程研究中心）为中国生物技术股份有限公司的全资子公司，按照中国生物的整体战略布局，公司定位为中国生物的研究开发中心、技术创新中心和人才培养中心。柯萨奇病毒A组6型（CVA6）是引起疱疹性咽峡炎及手足口病的主要病毒之一，严重时甚至可导致死亡。目前尚无有效治疗CVA6感染的药物，但随着关注度的不断提高，相关疫苗的研究取得了一定的进展。
数字PCR是测定病毒载量来评价疫苗保护效果的最佳手段。实验动物组织的病毒载量是评价疫苗保护效果的重要指标之一，传统的荧光定量PCR（quantitative PCR，qPCR）方法需用DNA或RNA标准品制作标准曲线，根据标准曲线计算样品的病毒载量从而进行绝对定量。但qPCR的定量检测结果受标准品的质量和扩增效率的影响，因此迫切需要全新的核酸检测和定量方法解决这一难题。数字PCR（digital PCR，dPCR）是新一代的核酸检测技术，因其灵敏度高、不依赖标准品即可直接进行绝对定量，已被广泛应用于临床诊断、基因表达分析、微生物检测等方向。
本研究中，国药中生生物技术研究院基于臻准生物芯片式数字PCR（chip-based digital PCR，cdPCR）系统，建立了cdPCR方法检测柯萨奇病毒A组6型（CVA6）病毒载量。通过优化反应条件确定cdPCR的最佳探针浓度和退火温度，利用CVA6病毒VP1基因的RNA标准品确立cdPCR的线性范围和检出限。随后对cdPCR测定CVA6病毒载量进行方法学验证。还利用cdPCR和qPCR两种方法检测了攻毒小鼠组织中CVA6的病毒载量，通过统计学方法分析了两种检测方法的一致性。
验证结果提示cdPCR方法的精密度、准确度和特异性均良好，一致性分析结果显示2种方法的一致性良好。本项研究，基于cdPCR的定量方法能准确反映RNA中CVA6病毒的载量，可应用于疫苗的保护效果评价，因cdPCR具有高灵敏度，在CVA6感染早期即可检出病毒，可以为传染病的的早期治疗和防控奠定基础。
数字PCR可以通过载量监测来构建病毒在不同器官和部位的感染复制模型。在本项研究中，利用建立的cdPCR方法检测小鼠组织（脑、心、肺、脾、肝、肠、肾、肌肉和脊柱等）RNA中CVA6病毒载量，经统计学分析发现肌肉和脊柱中的病毒载量明显高于其他器官，说明肌肉和脊柱是CVA6病毒感染小鼠后集中复制的部位。
本项研究内容丰富完整，包括方法建立、体系优化、性能测试（线性范围、检出限、精密度-中间精密度、精密度-重复性、准确度、芯片阅读的中间精密度、特异性、一致性分析），可以为开展类似研究和应用提供很好的参考。在本项研究中，对臻准生物数字PCR核心之一的微孔芯片阅读稳定性进行了测试，表现出优异的稳定性。
表 5 芯片阅读仪阅读结果的中间精密度
经方法学验证，芯片式数字PCR检测CVA6病毒载量的准确度与精密度均良好，尤其在低浓度检测时也具有较高的稳定性，由于cdPCR在低浓度检测时优越的灵敏度和稳定性，后续可通过大量的样本检测优化检出限，提高诊断方法的灵敏度和特异度将其应用于临床样本中CVA6病毒的检出。后续还可进行CVA10、CVA16、EV-A71 等其他肠道病毒cdPCR 定量方法的建立及验证。
普及数字PCR（digital PCR，dPCR）技术是臻准生物的使命和梦想，我们相信，随着数字PCR技术的不断进步，成本不断下降，其精准的直接定量分析，极好的数据重现性，可以使数字PCR在越来越多的核酸/基因分析场景中代替荧光PCR，发挥更精准的作用。
关于臻准
臻准生物科技(上海)有限公司2016年成立，总部位于上海环普云创国际科技园。公司作为上海市高新技术企业，致力于生命科学及体外诊断产品的研发生产和销售服务，团队成员来自知名跨国企业和科研院所，专业涵盖微纳加工、精密仪器、软件及算法、生物试剂研发等众多领域。目前，公司推出了具有完整自主知识产权的微腔芯片式数字PCR产品，基于该平台系统，已研发出覆盖肿瘤液体活检、病原感染、遗传检测、核酸药物质控等领域的多种检测试剂盒产品，并与北京大学、复旦大学、浙江大学、上海市计量测试研究院、上海市质量监督检验技术研究院、南京海关等知名院校及企事业单位达成合作。2019年和2022年，臻准生物先后完成数千万元和超亿元融资。