当今生命科学与医疗技术迅猛发展，细胞基因疗法逐渐成为继小分子化学药与抗体药物之后的第三代治疗手段，其中基因疗法可以从基因层面治疗包括肿瘤和罕见病在内的多种难以治疗的疾病，具有独特的优势。
在基因疗法中，病毒是理想的基因递送载体，其中腺相关病毒（AAV）由于致病性低，组织嗜性高，结构相对简单易于改造等特点，目前已成为行业内公认的最为理想的病毒递送载体之一。
以AAV作为载体开发基因治疗药物时，必须对多种关键质量属性进行检测，其中放行的最关键指标之一就是AAV病毒滴度测定，准确定量AAV载体病毒滴度对于毒理学及临床相关的给药剂量范围研究至关重要，对于保障患者安全、稳定批间剂量也具有重要意义。
qPCR法是目前各个研究机构及其药企采用最广泛的AAV基因组滴度定量方法，但其需要利用标准品生成标准曲线以提供相对定量，而且对抑制物敏感，易导致假阴性或定量偏差。为解决以上痛点，急需一种新的基因组滴度检测方法。数字PCR作为新一代核酸检测技术，可针对核酸分子做更精确的定量分析，无需标准曲线即可对目标分子进行直接定量。dPCR凭借其独特的技术原理和精准性能，正在被细胞和基因治疗行业快速接纳并应用。
dPCR技术原理及优势
dPCR的核心创新在于将传统PCR的“均相反应”转化为“微单元反应”，将样本分割成数万至数百万个独立微滴或微孔。
复杂样本适应性强：
通过微流控芯片或油包水微滴生成技术，将样本随机分配到独立反应单元。此时抑制剂也被稀释至单个反应单元，显著降低对扩增效率的影响，抗干扰能力强，可适用于病毒生产全流程监控。
直接定量：
区别于荧光PCR的扩增曲线法，数字PCR采用终点法判读，直接获得靶标核酸的浓度值或拷贝数。无需标准曲线，消除批次间误差，显著提升检测的稳定性。
灵敏度高：
PCR扩增结束后，判定荧光信号为阳性（靶标存在）或阴性（无靶标），根据阳性单元比例，通过泊松分布公式计算原始样本中的靶标拷贝数。可检测低至50copies/mL的痕量核酸，适用于低滴度样本或残留污染分析。
dPCR在AAV生产及检测中的关键应用场景
1. 特异性检测完整基因组
病毒使用过程中会产生一些没有插入治疗片段的空载体。如果不能准确定量这些低功能病毒，这可能会导致高估病毒滴度和产生低效力的治疗。利用对结构区和插入区双靶点进行双重扩增，就可以有效的进行病毒的完整性和插入效率评估，同时精确测定病毒基因组滴度，确保生产批次间一致性。
如图所示，用FAM通道标记ITR结构基因，用HEX通道标记插入的目的基因，可得到4组数据，FAM+/HEX+（完整AAV载体），FAM+/HEX-（空载体），FAM-/HEX+（游离目的基因），FAM-/HEX-（阴性）。
2. 残留污染物检测
rAAV生产通常涉及质粒转染、病毒包装、纯化等步骤，在这些步骤中，可能的杂质包括宿主细胞DNA、质粒残留等，dPCR可量化痕量污染物，保障产品纯度。
如图所示，用FAM通道标记ITR结构基因，用HEX通道标记宿主DNA/质粒基因，可得到4组数据，FAM+/HEX+（rAAV载体+杂质），FAM+/HEX-（rAAV载体），FAM-/HEX+（杂质），FAM-/HEX-（阴性）。
3. 生物分布与药代动力学研究
基因治疗药物在体内分布与持久性是临床安全性的关键。dPCR可检测动物组织中的AAV载体DNA，评估基因治疗的靶向性，为剂量优化提供数据支持。dPCR可检测治疗后数月甚至数年的AAV DNA残留，评估载体在体内的持久性。dPCR灵敏度高，支持早期时间点（如5分钟-1小时）的密集采样，精准绘制药时曲线。
臻准生物AAV检测方案
基于目前在AAV生物制剂检测上的需求，臻准生物研发推出了腺相关病毒核酸检测试剂盒（数字PCR法）。该试剂盒基于AAV病毒ITR区域的核酸保守区设计特异性引物和荧光探针，同时搭载新一代一体式微腔芯片（FlowArray）及MiniQuant数字PCR仪，可在2小时内，实现高灵敏性、高特异性、快速直接定量检测，为AAV研发生产质量控制贡献数字PCR解决方案。
臻准生物，参加中国食品药品检定研究院2024年“AAV基因组滴度测定能力验证”（编号：NIFDC-PT-461），结果评价为“满意”！
此外，臻准生物依托数字PCR（dPCR）技术平台与多年行业经验，可为您提供定制化AAV（目的基因）引物探针设计与体系优化服务，助力突破技术瓶颈，加速研发进程。
联系我们：021-64080619
结语
在基因治疗行业对AAV产品质量要求日益严格的背景下，尽管点杂交法和qPCR在特定场景中仍有应用价值，但dPCR在精准医疗和商业化生产中的不可替代性已得到广泛认可。未来，随着技术成本的降低和标准化指南的完善，dPCR有望全面普及，为基因治疗的安全性与有效性提供坚实保障，成为基因治疗质量控制的标配工具，加速安全有效疗法的临床转化。
臻准生物科技(上海)有限公司2016年成立，总部位于上海环普云创国际科技园。公司作为上海市高新技术企业，致力于生命科学及体外诊断产品的研发生产和销售服务，团队成员来自知名跨国企业和科研院所，专业涵盖微纳加工、精密仪器、软件及算法、生物试剂研发等众多领域。目前，公司推出了具有完整自主知识产权的微腔芯片式数字PCR产品，基于该平台系统，已研发出覆盖肿瘤液体活检、病原感染、遗传检测、核酸药物质控等领域的多种检测试剂盒产品，并与北京大学、复旦大学、浙江大学、上海市计量测试研究院、上海市质量监督检验技术研究院、南京海关等知名院校及企事业单位达成合作。2019年和2022年，臻准生物先后完成数千万元和超亿元融资。